假体周围感染兔模型中D-二聚体的动态表达与感染时间和种植细菌量的相关性研究
吴波文 蔡伟良 刘欢欢 刘银 李洁 朱宝玉 曾伟△
假体周围感染(Prosthetic Joint Infections，PJI)是全关节置换术中最严重的并发症之一[1]，因其难以诊断导致2年发病率达1%～2%[2-3]。因此，须寻找更敏感的PJI早期诊断指标。红细胞沉降率(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)、C-反应蛋白(C-reactive Protein，CRP)和白细胞数(White Blood Cell Count，WBC)已用于PJI诊断，但这些血清指标的检测尚缺乏敏感性和特异性。D-二聚体是体内严重感染的关键指标[4-6]，与PJI的关系尚不清楚。因此本研究建立PJI兔模型，监测D-二聚体的表达变化，明确其在PJI早期诊断中的价值。
1.1 材料与试剂
金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus，MSSA)购买于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，目录号35521)，并在本实验室保存。无特定病原(Specified Pathogen Free，SPF)级新西兰大白兔(成年，雄性，体质量(5.84±0.91)kg)购于湖南省实验动物中心。CRP、ESR、WBC试剂盒以及D-二聚体检测ELISA试剂盒均购于上海碧云天生物科技有限公司。
1.2 动物模型和分组
本研究的动物实验方案已由本院伦理委员会审批通过(审批号2020031107)，依照当前人初次人工髋关节置换多为生物型，通过3D打印技术制作兔生物型解剖型人工股骨头。构建假体周围感染动物模型：将注射生理盐水(MSSA含量为0)作为对照设为MSSA-A组，将MSSA分别以0.5×104，0.5×105，0.5×106cfu/mL浓度1 mL菌液注入关节腔，分别按顺序设为MSSA-B、MSSA-C、MSSA-D组，各10只。围手术期不用抗生素，术后兔分笼喂养，肢体不制动，随意活动。术后2周处死动物。选取体型大小基本一致日本大白兔40只，随机抽选3只完成计算机化X射线体层照相术(Computerized Tomography，CT)三维重建，通过计算机设计，3D打印人工股骨头，制作生物型解剖型人工股骨头及髓腔锉等手术工具；
人工股骨头仿当前临床常用假体，将钴-铬-钼合金的烧结多孔涂层烧结于钛合金假体上。
细菌培养：分别取MSSA菌株接种于血琼脂培养基，在37 ℃下培养24 h，挑选单个菌落用无菌0.9%氯化钠溶液2 mL将菌落洗脱并摇匀，用细菌浓度比浊仪配成0.5×106cfu/mL浓度的MSSA悬浊液。再根据实验要求细菌浓度，将其部分稀释并准备成0.5×105cfu/mL和0.5×104cfu/mL浓度分装备用。
构建动物模型：20 g/L戊巴比妥钠溶液30 mg/kg兔耳缘静脉麻醉，以左侧股骨大转子为中心，做长4 cm 的弧形切口，从左股前与外侧肌间隙进入髋关节，切除股骨头保留股骨距2 mm。以自制髓腔锉扩髓，插入假体，轻敲致假体固定牢固，保持20°～30°的前倾角，连续锁边缝合关节囊，再间断缝合关闭手术切口。为避免浅层软组织医源性感染，严密缝合关节囊及深部肌层后即用无菌针头将菌液注入关节囊(见图1)。
图1 手术过程大体图片
1.3 观察指标
首先进行大体观察：术后观察切口愈合情况，有无红、肿和生物膜形成。其次，在术前及术后1，7，13 d取各组白兔耳缘静脉抽取血液标本，记录WBC、CRP、ESR及D-二聚体数值。所有指标均严格按照生产商提供的说明书进行检测。
术后2周静脉注射苯巴比妥100 mg/kg对兔子实施安乐死。参照肌肉骨骼感染协会MSIS的诊断标准，假体周围感染的诊断需要满足至少一个主要指标(形成与假体相通的窦道或在两份独立的关节腔液标本中检测到致病菌)，本研究选取两块假体周围组织，如细菌培养均与接种菌相符，考虑假体周围感染兔模型构建成功。
使用无菌技术从手术部位收取植入的螺钉和垫圈，将垫圈用5 mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗5次，获取假体周围菌液原样本。对菌液进行涂板培养：培养18～24 h，通过菌落形态、涂片镜检进行确认，随后进行细菌计数。细菌阳性率=(接种菌的数量/总细菌的数量)×100%。
1.4 生物膜的电镜观察
13 d后静脉注射苯巴比妥100 mg/kg对兔子实施安乐死。使用无菌技术从手术部位收取植入的螺钉和垫圈。将垫圈用5 mL磷酸盐缓冲盐水冲洗5次，在固定剂(2.5%戊二醛)中保存24 h[7]。脱水并涂上金-钯后，随机选择一个观察区域并标记在垫圈上。然后，用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM)(日本东京JEOL有限公司)分析垫圈。由于螺钉形状不规则，因此无法通过SEM扫描。所有参与微生物实验和SEM研究的人员都不知道样品的类型和分组。
1.5 检测指标
比较MSSA-B、MSSA-C、MSSA-D之间菌液浓度和假体周围细菌阳性率。各组对比D-二聚体表达差异，明确D-二聚体在不同时间及不同细菌浓度所致假体周围感染中敏感性及特异性有无差异。分析D-二聚体与细菌感染的不同浓度的相关性及D-二聚体与感染时间的相关性。
1.6 统计学方法
2.1 假体周围感染兔模型的建立及评估
术后1周观察兔子的行为，模型组兔子明显出现右后肢体和左侧不协调，兔子拒绝触地，可明显观察到切口出现红肿等炎症特征，本实验中所有兔均无死亡。术前及术后1，7，13 d取各组白兔耳缘静脉抽取血液标本进行检测，统计CRP、ESR、WBC及D-二聚体的浓度(见表1-4)。
表1 各组白兔耳缘静脉抽取血液CRP含量
术后2周安乐死处死兔子，并从MSSA-B组、MSSA-C组、MSSA-D组的关节腔液标本中检测到金黄色葡萄球菌，与接种菌类型一致。另外，从MSSA-B组、MSSA-C组、MSSA-D组的关节腔液标本中检测到金黄色葡萄球菌，与接种菌也一致。以上结果表明假体周围感染兔模型构建成功(见图2)。
表2 各组白兔耳缘静脉抽取血液
表3 各组白兔耳缘静脉抽取血液D-二聚体的相对水平
表4 各组白兔伤口处WBC含量
2.2 感染后13 d葡萄球菌生物膜的形成
评估MSSA感染后13 d后假体关节生物膜形成的变化。用扫描电镜直接观察随机选取区域的假体生物膜的形成情况(见图2)，除MSSA-B组外，MSSA-C组和MSSA-D组可见生物膜大量形成，三组均可见密集的细菌堆积。
图2 扫描电子显微镜观察植入假体表面生物膜及附着葡萄球菌的图像(箭头指示生物膜，×1 000)
2.3 不同浓度细菌对假体周围细菌阳性率的影响
各组(B、C、D组)之间不同菌液浓度的假体周围细菌阳性率有差异(F=214.366，P=6.125×10-5)。与MSSA-B组(25.24±3.61)比，MSSA-C组(31.41±1.92)和MSSA-D组(51.36±2.88)的细菌阳性率明显增加，差异均有统计学意义(t=6.251，9.998；
P=0.014，0.005)。另外，与MSSA-C组比，MSSA-D组的假体周围细菌阳性率增加，差异均有统计学意义(t=4.552，P=0.023)。
2.4 D-二聚体的动态表达与感染时间的相关性
分析各组的D-二聚体的表达与感染时间的相关性(见表5)，D-二聚体和感染时间之间无相关性(P=0.588，0.247，0.099，0.062)。
表5 各组的D-二聚体水平与感染时间的相关性
2.5 D-二聚体的动态表达与细菌浓度的相关性
分析各组的D-二聚体的表达与细胞感染浓度的相关性(见表6)，在1，7，13 d时间点，D-二聚体和细菌浓度均正相关(P=0.003，0.002，0.001；
r=0.921，0.955，0.923)。
表6 术后1 d D-二聚体水平与细菌浓度的相关性
目前在临床实践中仍缺乏广泛采用的有效PJI诊断方法。以往研究主要集中于炎症标志物，而最近研究发现凝血级联反应的启动是PJI的常见早期事件，参与该过程的许多相关分子也是炎症反应的重要放大因子[8]。血液中D-二聚体是一种重要的凝血生物标志物，具有鉴定PJI的疑似病例或排除非PJI病例的潜在作用。
D-二聚体已用于监测与全关节置换术发生后深静脉血栓形成和失血有关的纤溶活性波动[9-10]。同时，D-二聚体本身充当炎症反应的调节剂和增强剂，并有助于感染性生物或炎症细胞的定位[11-12]。一项前瞻性队列研究共招募684名败血症患者，并观察到更高水平的D-二聚体与死亡率增加相关，该研究突显D-二聚体在败血症患者中的预后意义[13]。Xie等[14]的研究显示血浆D-二聚体水平在初次PJI后6 h达到峰值，维持升高24 h，并持续90 d恢复到术前水平。Parvizi等[15]提出了假体周围关节感染的新定义，并列出了三种循环标志物(CRP，D-二聚体和ESR)作为术前诊断的次要标准。与之前的研究一致，本研究观察到PJI葡萄球菌感染兔模型中D-二聚体明显升高，而且还进一步观察到与D-二聚体感染细菌浓度正相关。但是同样观察到CRP和ESR水平也随着感染细菌的浓度增加而持续增加，表明PJI的诊断可能同时需要血液D-二聚体、CRP、ESR水平的共同指示。
另外，血液中D-二聚体的诊断价值受到最近发表的几项研究的质疑，这些研究认为对原发性或持续性PJI的诊断仅具有中等敏感性和特异性[16-17]。有荟萃分析的研究总结表明，单个特异性D-二聚体测试的阳性结果仍不能诊断PJI。对于D-二聚体作为PJI的诊断生物标志物的价值判断，应保持保守的态度[18]。CRP和ESR都是急性期的指标，也是广泛建立的PJI血清标志物[16-17，19-20]。CRP，D-二聚体和纤维蛋白原的常规检测具有成本效益，CRP检测的价格约为ESR的两倍[21-23]。根据最新的荟萃分析结果[18]和本研究的结果，笔者推测D-二聚体结合ESR或D-二聚体结合CRP在诊断PJI中可能具有较好的应用前景。
由于大多数与假体相关的感染是由表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和MSSA引起的[24]，聚乙烯对表皮葡萄球菌极具吸引力，但是假体金属更适合MSSA的黏附[25]。因此，PJI治愈率的差异与多种复杂因素有关。浮游细菌附着在植入物上产生的生物膜使PJI的治疗更加困难，原因是生物膜可以抵抗宿主的细胞和体液免疫反应，而且对抗菌剂的敏感性低。另外，生物膜内的细菌生存时间更长，并成为细菌的来源，这些细菌扩散到植入物表面的其他部位，可以形成新的生物膜。本研究观察到中浓度和高浓度在13 d时已经有较多的生物膜形成，此时D-二聚体已经持续增加，但是无论高浓度或低浓度MSSA感染1 d即发现D-二聚体和细菌数量明显增加但是此时还未观察到生物膜形成。因此，D-二聚体的浓度变化对PJI的早期诊断有价值。
本研究中提出的动物模型复制了关节假体中常用的生物材料的关节内植入，但存在如下缺陷：首先，该动物模型与人类假体关节置换的力学模式不同。其次，这种动物模型适用于PJI中血液和其他指标的变化，但不适用于其他人工关节研究，例如关节假体松动。因此，仍需要开发更接近人类假体的人工关节动物模型。另外，需要进一步分析在不同菌种感染的假体模型中D-二聚体的变化与细菌感染的相关性，以确定D-二聚体是否可以作为最敏感的诊断标志物。
综上所述，金黄色葡萄球菌感染假体植入兔模型中可形成生物膜，而且D-二聚体与金黄色葡萄球菌浓度正相关，因此D-二聚体可作为一种极为敏感金黄色葡萄球菌的变化指标，与CRP及ESR指标有相当的诊断效能。
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