KCl替代NaCl对东北酸菜细菌菌群多样性的影响
解双瑜，孙 波，李 智，柳 凯，赵子伟
（东北农业大学 食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）
东北酸菜是一种东北传统发酵蔬菜制品[1-2]。其做法是将白菜完全浸入一定浓度的盐水（NaCl）中压实密封后接菌或自然发酵[3]。在酸菜发酵过程中，涉及到许多微生物的增殖与代谢作用[4-6]，其中以乳酸菌等能够产生乳酸的微生物为主[7-8]，同时还包含一些不利于酸菜发酵的有害菌，这些有害菌的耐盐性通常弱于乳酸菌，此时添加一定量的盐能够起到抑制杂菌滋生及调节白菜细胞渗透压的作用，因此传统酸菜中盐的添加量通常在3%～5%甚至更高[9-11]。而目前越来越多的研究表明，食盐中的钠摄入过多会增加人们患心脑血管疾病的风险[12-13]，因此减盐成为食品加工业发展的一大趋势。
在减盐的同时为了保证食品的品质，最有效的方式就是用其他盐类替代钠盐，最常用的就是氯化钾[14-16]。由于K+和Na+对于细胞渗透压和物质交换速率的影响程度不同[17]，氯化钾与氯化钠对于相同微生物的增殖与代谢会产生不同的影响[18-20]。而且在酸菜发酵过程中采用氯化钾替代氯化钠，也会对其中的微生物种群产生影响，这种影响可能会在一定程度上改变酸菜的品质。因此，通过比较不同KCl替代量对东北酸菜细菌菌群多样性的影响，研究K+和Na+对于东北酸菜发酵特性影响的差异性，为低钠酸菜产业的发展提供理论参考依据。
本研究以添加NaCl的酸菜作为对照组，采用不同比例的KCl替代其中的NaCl，使用高通量测序分析比较不同替代盐体系下自然发酵酸菜样品中细菌菌群多样性的变化，并分析其感官品质的变化。旨在保证东北酸菜发酵产品品质的同时，降低东北酸菜中的钠含量，为未来低钠酸菜的研究与开发提供依据。
1.1 材料与试剂
大白菜：黑龙江省哈尔滨市；
精制食用盐（食品级）：中盐天津市长芦盐业有限公司；
氯化钾（食品级）：河南万邦实业有限公司；
TIANamp Bacteria基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit提取试剂盒（离心柱型）：天根生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DDY-6C电泳仪：北京市六一仪器厂；
Bio-rad T100梯度聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国BIO-RAD公司；
Illumina NovaSeq 6000测序平台：美国Illumina公司。
1.3 方法
1.3.1 东北酸菜的制备和取样
东北酸菜的制备：取150 kg大缸，将75 kg挑选后的白菜原料洗净沥干后整颗码入缸中压实，在码放过程中按照白菜质量的3%加入具有不同氯化钾含量的盐。其中，SC1：100%NaCl；
SC2：25%KCl+75%NaCl；
SC3：50%KCl+50%NaCl；
SC4：75%KCl+25%NaCl；
SC5：100%KCl。码放完毕后每缸中加入75 kg水。自然发酵60 d后取样。
1.3.2 高通量测序分析
采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取酸菜样品的DNA，然后用1%琼脂糖凝胶电泳对基因组DNA的纯度和浓度进行检测[21]。检测合格后，用无菌水将基因组DNA样本稀释至1 ng/μL，并以此作为模板，使用通用引物314F（5"-CCTAYGGGRBGCASCAG-3"）和806R（5"-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3"）对16S rRNA基因的V3-V4区基因序列进行PCR扩增。PCR扩增体系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，Primer 3 μL，模板DNA（1 ng/μL）10 μL，双蒸水（ddH2O）2 μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性1 min；
98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共30个循环；
72 ℃再延伸5 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托天津诺禾致源生物信息科技公司基于Illumina测序平台，利用双端测序的方法，构建小片段文库进行双端测序。
1.3.3 感官品质评价
参考CHOI Y J等[22-23]的方法对东北酸菜样品的感官品质进行评价。挑选20名经过训练后的品评人员（10名男性和10名女性）组成感官小组，采用9点偏好量表从酸味、咸味、苦味、颜色、整体评价对酸菜进行质量描述分析。其中酸味、咸味和苦味采用9分制评分，1=很弱，3=弱，5=中等，7=强，9=非常强。颜色和整体评价使用9分制进行评分，其中1=非常不喜欢，3=不喜欢，5=无喜恶，7=喜欢，9=非常喜欢。所有样品在不告知感官评价小组成员的条件下随机编号。感官评价小组成员每品尝完一个样品后，用清水漱口，再进行下一个样品的品尝。
1.3.4 数据处理及分析
采用SPSS 27.0分析处理实验数据，结果以“平均值±标准差”表示，并进行显著性分析，当显著水平P＜0.05时，具有统计学意义；
采用Origin 9.0软件处理作图。
2.1 不同酸菜样品的细菌菌群Alpha多样性分析
稀释曲线和等级聚类曲线是常见的描述组内细菌物种多样性的曲线，不同酸菜样品细菌菌群的稀释曲线与等级聚类曲线见图1。由图1可知，各酸菜样品的稀释曲线在30 000时趋向平稳，说明测序数据量渐进合理。等级聚类曲线可直观的反映细菌物种丰富度和均匀度[24]。由图1亦可知，SC5样品细菌菌群的丰富度与均匀度最高。
图1 不同酸菜样品细菌菌群的稀释曲线（A）与等级聚类曲线（B）Fig.1 Dilution curves (A) and hierarchical clustering curves (B) of bacterial flora in different sauerkraut samples
不同KCl替代量酸菜样品的细菌菌群Alpha多样性分析结果见表1。Observed-species、Chao1指数和ACE指数代表细菌菌群的丰富度；
数值越大，细菌菌群丰富度越高。Shannon指数和Simpson指数代表细菌多样性；
Shannon值越大，Simpson指数越小，细菌多样性越高[25]。由表1可知，随着KCl替代量的增加，细菌菌群多样性整体呈现持续增加的趋势，丰富度呈现先降低后增加的趋势。当KCl替代量达到100%时，其细菌菌群多样性与丰富度均高于未添加KCl的样品，这与等级聚类曲线所示结果相同。
表1 不同酸菜样品细菌菌群的Alpha多样性分析结果Table 1 Alpha diversity analysis results of bacterial flora in different sauerkraut samples
2.2 不同酸菜样品细菌菌群结构分析
2.2.1 基于门水平不同酸菜样品细菌菌群结构分析结果
从酸菜样品中共检测到20个细菌菌门，其中KCl替代量为50%的酸菜样品菌门种类最少（11个），KCl替代量为100%的酸菜样品菌门种类最多（17个）。基于门水平，不同KCl替代量酸菜样品的细菌菌群结构见图2。由图2可知，在所有酸菜样品中，占据最优势地位的门是厚壁菌门（Firmicutes），其在KCl替代量为50%的酸菜样品中相对最高达94.6%，在KCl替代量为100%的酸菜样品中相对丰度最低为63.3%。KCl替代量为0的酸菜样品中还存在29.2%的变形菌门（Proteobacteria），但在含有KCl的所有酸菜样品中变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度均＜8%。此外KCl替代量为100%的酸菜样品中还存在着27.0%的放线菌门（Actinobacteriota），而其相对丰度在其他酸菜样品中均＜2%。结果表明，KCl替代量的增加会导致酸菜中出现新的优势菌门，但酸菜中优势菌门的相对丰度可能与KCl替代量之间无线性关系。
图2 基于门水平不同酸菜样品细菌菌群结构分析结果Fig.2 Analysis results of bacterial community structure of different sauerkraut samples based on phylum level
2.2.2 基于属水平不同酸菜样品细菌菌群结构分析结果
从酸菜样品中共检测到454个细菌菌属，其中KCl替代量为50%的酸菜样品菌属种类最少（222个），KCl替代量为100%的酸菜样品菌属种类最多（252个）。基于属水平，不同KCl替代量酸菜样品的细菌菌群结构见图3。由图3可知，在每个酸菜样品中，乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度都是最高的。在KCl替代量为0的酸菜样品中，Lactobacillus的相对丰度为66.5%，当KCl替代量增加至25%时，酸菜样品中Lactobacillus的相对丰度为85.8%，随后随着KCl替代量的增加逐渐下降，当KCl替代量为100%时，酸菜样品中的Lactobacillus相对丰度为58.6%。明串珠菌属（Leuconostoc）与乳球菌属（Lactococcus）存在于每个酸菜样品中，且均在KCl替代量为50%的酸菜样品中最高，此时Leuconostoc与Lactococcus的相对丰度分别为5.4%和1.8%。此外，在KCl替代量为0的酸菜样品中存在5.1%的克雷伯杆菌属（Klebsiella），在KCl替代量为100%的酸菜样品中存在17.1%的双歧杆菌属（Bifidobacterium），这两种菌属虽然在其他样品中也存在，但其相对丰度均＜0.1%。拉恩氏菌属（Rahnella1）只存在于KCl替代量为0的酸菜样品中，而盐池栖菌属（Halostagnicola）在KCl替代量为0的酸菜样品中未检出，其余酸菜样品中均能检测到，且其相对丰度随KCl替代量的增加而逐渐增加，当KCl替代量达到100%时，其相对丰度达到3.6%。
图3 基于属水平不同酸菜样品的细菌菌群结构分析结果Fig.3 Analysis results of bacterial community structure of different sauerkraut samples based on genus level
2.3 不同酸菜样品基于OTU的Venn图
不同酸菜样品基于操作分类单元（operationaltaxonomic units，OTU）的韦恩图见图4。由图4可知，在酸菜的发酵过程中，大部分的细菌属都是相同的，但仍有部分细菌属随KCl替代量的变化而有所不同。随着KCl替代量的增加，不同酸菜样品的特有OTU数量呈现先减少后增加的趋势。当KCl替代量为100%时，其特有OTU数量最高为47个，当KCl替代量为50%时，其特有OTU数量最低为15个。结果表明，在酸菜样品中同时存在NaCl与KCl时，样品中的菌群种类相似度较高，而当样品中只有NaCl或KCl时，样品中就会出现与其他样品中不同的菌群种类。
图4 不同酸菜样品操作分类单元的Venn图Fig.4 Venn diagram of operational taxonomic unit of different sauerkraut samples
2.4 不同酸菜样品物种差异性分析
选取平均相对丰度排名前30的细菌属，根据其在每个酸菜样本中的相对丰度信息，从物种和样本两个层面进行聚类分析，结果见图5。
图5 不同酸菜样品物种丰度聚类热图（a）及β多样性指数热图（b）Fig.5 Heatmap of species abundance clustering (a) and β diversity index (b) of different sauerkraut samples
由图5a可知，SC2样品与SC3样品之间的相似度比较高，其次是SC4样品。说明当KCl替代量在25%～75%时，酸菜样品之间细菌群落的相似度较高，而KCl替代量为0与100%时，与其他样品之间的相似度较低。由图5b可知，差异最小的两个样品为SC2与SC3样品，其相异系数为0.038，差异最大的两个样品为SC1和SC5，其相异系数为0.363。SC2、SC3样品与SC4样品的相异系数均为0.064。且SC1、SC5样品与其他样品间的相异系数均＞0.2。说明当KCl替代量为0或100%时，其样品与其他样品之间的菌群差异较大，这与物种丰度聚类热图的分析结果一致。
2.5 不同酸菜样品的感官品质评价
不同酸菜样品的感官品质评价见图6。由图6可知，KCl替代量对于酸菜的咸味与颜色并没有显著的影响（P＞0.05）。而对酸菜的酸味、苦味与整体评价有显著的影响（P＜0.05）。当KCl替代量为0时，酸菜的酸味评分与整体评价分别为7.0分和7.9分，这两个评分随着KCl替代量的增加而减少，当KCl替代量达到100%时，酸味评分与整体评价分别显著降低至4.8分和2.0分（P＜0.05）。当KCl替代量为0时，酸菜的苦味评分为1.4分，其评分随着KCl替代量的增加而逐渐增加，当KCl替代量达到100%时，苦味评分增加至5.7分。同时从图7亦可知，当KCl替代量到达50%时，酸菜的苦味与整体评价发生了显著性的变化。这说明KCl替代NaCl的量不宜超过50%。
图6 不同酸菜样品的感官评价Fig.6 Sensory evaluation of different sauerkraut samples
本研究采用高通量测序技术分析了KCl替代NaCl对于东北酸菜中细菌菌群多样性的影响。结果表明，KCl替代NaCl会增加酸菜细菌菌群的多样性和丰富度，同时当KCl替代量逐渐增加时酸菜中会出现新的细菌菌群，其相对丰度也会随着KCl替代量的改变而发生变化，但这种变化与KCl替代量不呈现线性相关。当KCl替代量在25%～75%时，酸菜样品之间细菌群落的相似度较高，而KCl替代量为0与100%时，与其他酸菜样品之间的相似度较低。当KCl替代量＞50%时，酸菜会出现明显的苦味，整体感官评分显著下降。因此KCl替代NaCl的比例不宜超过50%。该实验结果能为未来低钠酸菜的研究与开发提供依据。未来的研究还应围绕对酸菜发酵工艺的改进，以期达到在保障酸菜品质的同时减少NaCl添加量的目的。
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