基于网络药理学研究连翘抗炎作用机制
刘文倩，高耀，张立伟，李石飞*
（1.山西大学 分子科学研究所， 化学生物学与分子工程教育部重点实验室， 山西 太原 030006；
2.山西大学 中医药现代研究中心， 山西 太原 030006）
中药连翘是木犀科植物连翘Forsythia sus⁃pensa （Thunb.） Vahl的干燥果实，主要分布于我国的山西、陕西，河南和山东等地。连翘气微香、味苦、性微寒、归肺心、小肠经，具清热解毒，消肿散结，疏散风热等效用，是有着千年历史的传统中药［1］。连翘散结消肿、清热解毒的药效在多方面得到体现，主要包括抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物、解热等。连翘被广泛运用于临床，是许多中药复方制剂的重要成分，如连花清瘟胶囊，双黄连含片，牛黄上清片等［2-3］。
炎症作为一种常见而又十分复杂的病理现象，它是机体对刺激及损伤产生的一种防御反应。炎症一般对机体是有益的，但严重的炎症亦会伤害机体，炎症与多数疾病都有密切的联系［4-5］。连翘具有较强的抗炎作用，临床上用于治疗炎症相关疾病，如急性风热感冒，痈肿疮毒等［6］。对于连翘化学成分的相关研究，已知从连翘中可分离出达300多种化学成分，主要化学成分多达150多种，包含有黄酮类、木脂素类、苯乙醇苷类以及挥发油类等。其中连翘苷，槲皮素，木犀草素等均报道有良好的抗炎活性［2，5］。相关文献报道，厉世伟等研究连翘有效成分对炎症模型的作用，结论得连翘提取物对炎性细胞有不同程度保护，具有一定的抗炎作用［4］。王越等研究连翘成分连翘苷对LPS刺激的BV2小胶质细胞炎性反应的抑制作用，结果表明连翘苷能够抑制小胶质细胞活化产生的炎症反应［7］。陈泽文等研究连翘不同极性部位的抗炎活性，结果表明连翘的部分提取物具有良好的抗炎活性［8］。目前关于连翘抗炎的研究有很多，大多研究了连翘的各种成分表现出的抗炎活性，然而在系统阐明连翘抗炎具体作用机制及相关作用等方面的研究相对缺乏。因此我们需要进一步加强对连翘抗炎作用机制的研究。
中药注重整体性，并在功效上表现多样性特点。其分子机制相对复杂， 难以深入研究。而网络药理学是一门将信息网络与计算机科学相结合，基于系统生物学和多向药理学理论的新学科，其特点具整体性和系统性，与中医药整体性原则相吻合［9-10］。从网络药理学这门技术上可以获得“多成分-多靶点”的相互联系及蛋白互作关系，预测中药及其分子作用机制，使得中药研究得以更好延伸。本研究以连翘抗炎作出发点，通过网络药理学的方法来研究连翘抗炎的作用机制，为连翘后期研究提供相关理论依据。
1.1 连翘活性成分收集与筛选
本研究经中医药系统药理学数据库TC⁃MSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索连翘的活性成分信息。口服药物在体内经过吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabo⁃lism）及排泄（excretion）的过程，为ADME过程。口服生物利用度（OB，oral bioavailability）是衡量中药临床药效的有效指标，类药性原则（DL，drug likeness）是指化合物与已知药物的相似性。所以本研究以OB≥30%及DL≥ 0.18的2个条件进行筛选以获得有效的活性成分［11-12］。
1.2 连翘活性成分作用靶点的预测与筛选
将TCMSP数据库筛选得到活性成分的化学 结 构 数 据 导 入 PharmMapper（http：//lilabecust.cn/pharmmapper/）平台进行预测靶点，再将每个成分的预测结果的Z值进行降序，分别选择前50个结果进行后续研究［12］。并使用Uniprot蛋 白 质 数 据 库（https：//www.uniprot.org）规范靶点信息。
1.3 炎症靶点的收集与筛选
通过 OMIM 数据库（https：//omim.org/）和TTD数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）检索炎症靶点，以“inflammation”为关键词进行检索，其中OMIM数据库选带有“*”的炎症靶点。收集两个数据库与炎症相关的靶点信息并进行整合。再将预测靶点与炎症靶点取交集得到共同靶点，并绘制韦恩图。
1.4 构建“连翘成分-预测靶点”和“连翘成分-炎症靶点”网络图
将连翘的活性成分，预测靶点，交集的炎症靶点建成EXCEL数据，将其导至Cytoscape 3.8.1（http：//www.cytoscape.org/）软件中，利用该软件构建“连翘成分-预测靶点”，“连翘成分-炎症靶点”，以探究连翘抗炎作用机制。运用“Net⁃work analyzer”功能分析相关属性， 导出接近中心性ClosenessCentrality，中介中心性Between⁃nessCentrality，点度中心性Degree等参数，Degree为每一个节点拥有边的数量，一个节点的De⁃gree越大，说明该节点在网络中就越重要。
1.5 蛋白靶点 PPI（Protein-Protein Interaction）网络的构建
取交集靶点导入到String平台（https：//string-db.org），生物种类设为人类，其余为默认设置，得到蛋白互作（PPI）网络，再利用Cyto⁃Scape3.8.1软件中的MCODE插件进一步分析PPI网络，得到蛋白互作关系的高密度子网［13］。
1.6 连翘抗炎靶点的功能与通路富集分析
将交集靶点上传至DAVID数据库，进行GO（Gene Ontology）功能和 KEGG（Kyoto Ency⁃clopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。所得结果以P<0.05为界，GO分析选取前10个富集结果和KEGG分析选取前20个富集结果并利用R语言进行可视化，并构建“连翘抗炎靶点-通路”网络图。
2.1 连翘活性成分及成分靶点的获取
经TCMSP数据库获得150种连翘活性成分，再经OB≥30%及DL≥0.18筛选后获得21个连翘活性成分。21个成分分为8种类型结构，分别为：7个木脂素类及其苷类，4个黄酮类，1个C6-C2天然醇及其苷类，2个甾醇类，4个萜类，1个醌类，1个有机酸类，1个生物碱物质，详见表1。
21个活性成分经PharmMapper平台预测靶点并筛选，再删除重复靶点得254个靶点，最后又经Uniprot数据库规范得230个。
2.2 炎症靶点的获取
通过OMIM数据库输入“inflammation”关键词得1091个炎症靶点，又经筛选带有“*”符号的靶点获得818个炎症靶点。另外使用TTD数据库输入“inflammation”得120个炎症靶点。最后整合得871个炎症靶点。将所得的连翘活性成分预测靶点与炎症靶点取交集，得到交集靶点45个，并绘制韦恩图，如图1所示。
2.3 构建“连翘活性成分−靶点”网络图
使用Cytoscape3.8.1软件构建“连翘活性成分-预测靶点”网络图（共251个节点，其中21个成分节点和230个预测靶点；
共949条边），绿色六边形为21个成分，黄色和蓝色菱形为230个靶点，其中黄色为度值≥11的靶点，如图2所示。在该网络中，分析其拓扑学参数，其中有 6个预测靶点可以与15个及以上的化合物相互作用。度值≥15的靶点有碳酸酐酶-2（Carbon⁃ic anhydrase 2），细胞分裂蛋白激酶 2（Cell divi⁃sion protein kinase 2），酪氨酸蛋白磷酸酶非受体1型（Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 1），凝血酶原（Prothrombin），雄激素受体（Androgen receptor），热休克蛋白 HSP 90-alpha（Heat shock protein HSP 90-alpha），详见表 2。由上述可知，连翘的有效活性成分与相应靶点之间存在一个成分对应多个靶标、一个靶标对应多个成分的关系，这体现了连翘多成分、多靶点共同作用的机制。
构建“连翘活性成分-炎症靶点”网络图（共66个节点，其中21个成分节点和45个炎症靶点；
共211条边），绿色菱形为连翘21个活性成分，淡粉色方形为45个炎症靶点。分析网络图可以得到连翘抗炎的核心成分，网络分析表明：其中有8个活性成分的度值在11及以上，依次为 MOL000098（槲皮素），MOL003281（20（S）-达玛烷-24-烯-3β，20-二醇-3-乙酸酯），MOL003305（连翘苷），MOL003322（4-［（3R，6S）-3-（3，4-二甲氧基苯基）-1，3，3a，4，6，6a-六氢呋喃［3，4-c］呋喃-6-基］-3-甲氧基苯酚），MOL003283（（+）-异落叶松树脂醇），MOL003344（β-香树脂醇乙酸酯），MOL000006（木犀草素），MOL003308（（+）-松脂醇单甲醚-4-D-β-葡萄糖苷），如图3所示。
2.4 蛋白靶点PPI网络的构建
取交集靶点提交至 String平台，得PPI 网络图，经Cytoscape3.8.1软件修饰得图45个节点，216条边。度值越大，颜色越深，其平均度值9.6，如图4所示。为更精确地分析连翘抗炎的作用机制，运用Cytoscape3.8.1中的MCODE 插件，得高密度子网，其靶点为45个靶点度值前14个靶点，可见度值越高，在PPI网络中越重要。由图可知，连翘抗炎主要与丝裂原激活蛋白激酶 14（MAPK14），SRC 蛋白激酶（SRC），胰岛素样生长因子1（IGF1），丝裂原激活蛋白激酶 1（MAPK1），表皮生长因子受体（EGFR），丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8），白细胞介素2（IL2）， 信 号 转 导 与 转 录 激 活 因 子 1（STAT1），90KDA热休克蛋白AA1（HSP90AA 1），基质金属蛋白酶2（MMP2）等靶点密切相关，如图5所示。
2.5 连翘抗炎靶点功能与通路的富集分析
经分析并借助R语言对结果可视化得：连翘参与的生物学过程（BP，Biological Process）主要有细胞对脂多糖的反应（Cellular response to lipopolysaccharide），Peptidyl-serine磷酸化（Pepti⁃dyl-serine phosphorylation），细胞对胰岛素刺激的反应（Cellular response to insulin stimulus），凋亡过程的负调控（Negative regulation of apoptotic process），来自RNA聚合酶Ⅱ启动子转录起始（Transcription initiation from RNA polymerase Ⅱpromoter）等过程。连翘主要参与的细胞组成（CC，Cellular Component）有细胞外间隙（Estra⁃cellular space），细胞核（Nucleus），细胞质核周区域（Perinuclear region of cytoplasm），胞质溶胶（Cytosol），核质（Nucleoplasm）等成分。连翘抗炎靶点的功能（MF，Molecular Function）主要有类固醇激素受体活性（Steroid hormone receptor activity），蛋白质酪氨酸激酶活性（Protein tyro⁃sine kinase activity），受体信号蛋白酪氨酸激酶活性（Receptor signaling protein tyrosine kinase ac⁃tivity），酶 结 合（Enzyme binding），蛋 白 结 合（Protein binding）等功能，如图6所示。
此外，KEGG通路分析结果显示得相关通路有癌症通路（Pathways in cancer），催乳激素信号 通 路（Prolactin signaling pathway），结 核 病（Tuberculosis），破骨细胞分化 （Osteoclast differ⁃entiation），丙型肝炎（Hepatitis C），PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway），GnRH 信号通路（GnRH signaling pathway），Rap 1信号通路（Rap 1 signaling pathway），Ras信号通路（Ras signaling pathway），如图7所示，富集通路结果详见表3。最后构建抗炎靶点-通路图，以选取的20条KEGG通路及所涉及的27个抗炎靶点作图，并分析其拓扑参数。网络分析得，MAPK1、MAPK8、EGFR、MAPK14度值分别为19、14、13、12，在网络中度值占最高，为关键靶点，如图8所示。
连翘是临床常用清热解毒要药，在风热感冒、乳痈、瘰疬、丹毒、温病初起、痈疽等热证治疗显示出显著疗效。现代药理学研究显示，连翘在抗病毒、抗肿瘤、抗炎等方面均显示出作用。其中抗炎作为连翘的主要药理作用之一，目前只是在研究连翘的不同化学成分的抗炎活性较为充分，但连翘抗炎作用机理的研究却相对缺乏。本研究利用网络药理学的方法从连翘抗炎的活性成分、作用靶点、相关通路等方面对作用机制进行了探讨。从连翘的活性成分筛选出连翘抗炎的核心成分为槲皮素、连翘苷、木犀草素等。槲皮素为多醇羟基黄酮类化合物，具有抗炎，免疫调节，抗癌，抗氧化等作用。经研究发现，槲皮素可通过抑制NF-κB通路，降低炎症因子表达，达到抗炎目的［14］。木犀草素是存在于许多药用植物中的典型C6-C3-C6结构的黄酮类化合物，且具有多种药理活性。木犀草素发挥抗炎作用，其通过影响花生四烯酸的代谢，多条炎性信号通路如NF-κB信号通路、MAPK和AP-1信号通路及抑制炎症因子表达等多种途径抗炎［15-16］。相关研究揭示了木犀草素与槲皮素在体外表现良好的抗炎效果［17］。有文献报道连翘苷对炎症因子具有抑制作用，表现出良好的抗炎活性［18-19］。
在连翘抗炎的蛋白相互作用网络中通过构建高密度子网，有14个蛋白靶点起关键作用，其核心靶点为 MAPK14、SRC、IGF1、MAPK1、EGFR等。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），具有调控促炎因子的作用。MAPK 家族可分为p38、JNK和ERK，其中p38，JNK在炎症反应中发挥重要作用［20］，MAPK14 蛋白激酶是 4 个p38 MAPKs 之一［12］。MAPK1是MAPK 家族一员，参与炎症反应，它的激活可促使炎症因子的表达［21］。SRC是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，它参与细胞的生长、发育和分化等过程且发挥重要作用，并与肿瘤的发展密切相关［22］。IGF1作为一种重要的生长因子，以自分泌或者是旁分泌的方式促使成骨细胞的增殖、分化、维持骨代谢的平衡，从而促进骨形成［23］。EG⁃FR 作为一种I型跨膜糖蛋白，经诱导形成二聚体，再磷酸化后激活下游信号通路，从而影响细胞的增殖、分化与存活［24］。
由本研究中气泡图气泡的颜色和大小，得出连翘抗炎的主要通路有癌症通路、催乳激素信号通路、结核病、破骨细胞分化、丙型肝炎、PI3K-Akt信号通路等。癌症严重威胁着人类健康，是全球性的公共卫生问题之一［25］。炎症因子与癌症密切相关，其参与了肿瘤的发生、促进、恶性转化、侵袭及转移病理过程，并且核转录因子NF-κB在炎症与肿瘤之间起着重要作用［26］。Prolactin是一种多肽激素，具有作为激素和细胞因子的生物活性功能［27］。它参与生物过程广泛，包括神经调节，泌乳，情绪反应，细胞生长增殖，内分泌以及免疫调节［28］。催乳素还通过对星形胶质细胞白细胞介素功能的旁分泌调节，在神经炎性反应相关过程中发挥关键作用［29］。结核病是一个连续体，由一系列病变组成，是炎症复杂调节的结果，促炎因子包括干扰素、TNF-α、IL-1以及微小核糖核酸和类花生酸在结核病期间形成一个互作网络。结核病是由一种高度健壮和复杂的细菌病原体结核分枝杆菌引起的，结核病的特点是潜伏和活动期的炎症不消退。结核病是一种局部疾病，典型集中在肺，即肺结核［30-31］。目前临床主要通过抗炎、祛痰及止咳等方式治疗肺结核［32］。破骨细胞由单核细胞融合分化而成，是骨吸收的功能细胞［33］，在骨骼发育和维持中起重要作用，破骨细胞异常活化时会导致各种骨相关疾病的发生。据文献报道，有许多中医药基于NF-κB信号通路来调控破骨细胞分化［34］。丙型肝炎是由于感染丙肝病毒（HCV）所导致。丙肝病毒是一种有包膜的RNA病毒，属于类肝素病毒属和黄病毒科［35］。丙型肝炎的分子机制与多条炎症信号通路相关，如MAPK、NF-κB等信号通路［36］。PI3K-Akt途径是许多系统中细胞生长的重要调节因子，PI3K（磷酸肌醇3-激酶）家族由1类、2类和3类激酶组成，它们将PIP2（磷脂酰肌醇二磷酸）磷酸化为PIP3。1类PI3K激酶参与Akt（蛋白激酶B）的激活，Akt激活导致许多下游蛋白质的刺激，影响细胞生长、存活以及分化［37］。相关文献报道，PI3K-Akt信号通路参与炎症反应，并发挥较明显的调控作用［38-40］。
综上所述，本研究通过网络药理学方法对连翘抗炎作用机制进行了初步预测，分析了连翘抗炎相关靶点及所涉及通路，为后续研究提供了指导意义。基于上述结果，可以发现连翘在抗炎作用中是多个活性成分参与多个靶点的调控，同时一个靶点也参与调控多条信号通路，符合中药的多成分，多靶点，多种途径的特征。
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