一起兔瘟疫情的诊断与防控建议

韦登国， 谭舒华， 赵 超， 姜德荣

(1. 贵州省平塘县农业农村局，贵州 平塘 558300；

2. 贵州大学动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025；

3. 黔西南布依族苗族自治州乡村振兴局，贵州 兴义 562400)

兔瘟是由兔出血症病毒(RHDV)引起的1种急性、败血性传染病，以实质器官出血、水肿和肝脏坏死为特征，一年四季均可发生，发病急，传播快，发病率及病死率高，易感兔发病率为90%，病死率可达100%[1～4]。2021年12月，贵州省平塘县牙舟镇某肉兔养殖场发生以呼吸系统症状为主要特征的疾病。为确诊病原，采集3只病兔的肝脏组织送贵州大学贵州省动物疫病研究室进行实验室检测。

该场存栏伊拉兔12 000只，2021年12月19日个别兔出现死亡现象，临床症状表现为口腔和鼻腔流出血样液体，体温升高，呼吸困难，突然死亡。12月20日兔死亡数量增加，兔场立即对未发病的兔进行兔瘟疫苗紧急接种，但发病和死亡未得到有效控制，至12月26日兔死亡近10 000只，发病率83.33%，病死率100%。

该场近6个月内没有从场外引进种兔，2021年12月15日场主用1辆私人小货车运送300只商品兔到场外销售，车辆和人员回养殖场后未进行消毒，随后出现兔发病死亡。

对3只病兔进行剖检，可见肝脏水肿、质脆、出血(见图1)，肺脏水肿、出血(见图2)，气管充血、出血，其他组织器官无明显变化。根据病理变化，疑似兔瘟或巴氏杆菌病。

图1 肝脏水肿、质脆、出血

图2 肺脏水肿、出血

4.1 检测病料无菌采集3只病兔的肝脏组织作为检测病料，重点进行兔出血症病毒和巴氏杆菌核酸检测。

4.2 主要试剂柱式DNA和RNA提取试剂盒、2×TaqPCR Mix、DL 2 000 DNA Maker，购自宝生物工程(大连)有限公司；
兔出血症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒、兔出血症病毒一步法RT-PCR诊断试剂盒(内含RT-PCR反应液、酶混合液、引物RHD、阳性对照、阴性对照、ddH2O)，购自山东绿都生物科技有限公司。

4.3 主要仪器荧光定量PCR仪(型号：BIO-RAD，上海艾研生物科技有限公司)、PCR仪(型号：VeritiTM96-Well Thermai Cycler，美国ABI公司)、电泳仪(型号：DYY-8C，北京六一生物科技有限公司)。

4.4 引物按照参考文献[5]中多杀性巴氏杆菌KMT1基因检测引物序列(见表1)，由上海生物工程股份有限公司合成，按说明书稀释至10 μmol/L，-20 ℃冻存备用。

表1 多杀性巴氏杆菌引物信息

4.5 兔出血症病毒核酸检测

4.5.1 实时荧光定量PCR用柱式RNA提取试剂盒分别提取3份肝脏组织的总RNA，用兔出血症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒进行检测。试验成立条件：阴性对照无Ct值或Ct值>32，且无特异扩增曲线；
阳性对照Ct值<25，且有特异扩增曲线。结果判定：检测样品Ct值≤30，且出现特异扩增曲线，判为阳性；
检测样品Ct值>32或无Ct值，且无扩增曲线，判为阴性；
检测样品302号样品ct值<32，且出现特异扩增曲线，判为可疑。对2号样品采用一步法rt-pcr进行复检。< p>

+：阳性对照；

-：阴性对照；

1～3：检测样品图3 兔出血症病毒实时荧光定量PCR检测结果

4.5.2 一步法RT-PCR采用兔出血症病毒一步法RT-PCR诊断试剂盒(目的片段440 bp)对2号样品进行检测。反应体系20 μL：RT-PCR反应液10 μL，引物RHD 2 μL，酶混合液0.8 μL，模板RNA 2 μL，ddH2O 5.2 μL。反应条件：94 ℃预变性 5 min，50 ℃ 30 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共34个循环；
72 ℃终延伸 6 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳。结果显示2号样品于440 bp处出现特异条带(见图4)。确诊2号样品存在兔出血症病毒感染。

M：DL 2 000 DNA Marker；

+：阳性对照；

-：阴性对照；

2：2号样品图4 兔出血症病毒一步法RT-PCR检测结果

4.6 巴氏杆菌核酸检测用柱式DNA提取试剂盒分别提取3份肝脏组织的总DNA，用巴氏杆菌KMT1基因检测引物进行PCR扩增(目的片段460 bp)，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，未出现特异条带，表明无巴氏杆菌感染。

通过流行病学调查、病理剖检、相关病原核酸检测，诊断此次疫情为兔出血症病毒感染引发的兔瘟。鉴于该场兔发病及死亡较多，已无太大治疗价值，为避免疫情继续传播蔓延，2022年1月3日对兔场剩余兔全部扑杀并进行了无害化处理。

6.1 免疫失败疫苗保存不当或免疫注射不规范造成免疫失败。

6.2 养殖场选址不合理该养兔场位于县道边，且没有建设围墙，养殖场和管理用房(饲料房)分别位于道路的两侧，饲养员必须横穿县道才能进入养殖场，不利于疫病防控。

6.3 防疫制度不严格，防疫意识差外来人员可随意进入兔舍参观，饲养人员没有进行彻底消毒就进入兔舍；
运输商品兔和饲料的车辆没有分开，装卸前后未对车辆进行严格清洗消毒，造成车辆或人员携带病原进入兔场引发疫情。

加强生物安全防控和免疫预防接种是预防兔瘟的主要措施。要坚持自繁自养，加强饲养管理，做好防虫、防鼠工作，合理安排养殖密度(每笼1～2只)，保证适当光照和通风。做好兔舍卫生和消毒工作，兔笼、饲养用具及场内外环境用2%来苏儿溶液、4%氢氧化钠溶液交替消毒，每周至少消毒1～2次。病兔淘汰或隔离，死兔焚烧或深埋。不从疫区引种，引种时进行严格检疫与隔离观察。建立严格的防疫制度，禁止外来人员及运输工具未经消毒直接进入养殖场内。建立科学的免疫程序：30～40日龄兔皮下注射兔瘟-巴氏杆菌二联苗1 mL，1个月后加强免疫1次，之后每4个月免疫 1次。

疫苗应规范管理，按说明书要求存放于合适的温度环境。

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